目的 探讨PCR测序法、AS-PCR法、多重荧光PCR法检测肺炎支原体（MP）及大环内酯类耐药肺炎支原体（MRMP）的临床意义。方法 采集呼吸道感染患儿的咽拭子样本116例，使用PCR测序法、AS-PCR法、多重荧光PCR法检测MP和MRMP，探讨三种方法的特点和临床价值。结果 共采集116份咽拭子样本，PCR测序法检测MP阳性69例，阳性率59.48%，其中耐药株67例，包含1株耐药株与敏感株混合感染，耐药率97.1%，均为A2063G点突变，敏感株2例。AS-PCR法检测MP阳性63例，阳性率54.31%，其中耐药株58例，耐药率92.06%，敏感株5例，58例耐药株中混合感染21例，混合感染率33.33%（21/63），混合感染中18例耐药株比例超过50%。与PCR测序法比较，对MP阳性检测结果一致性极好（Kappa=0.86），对MRMP检测结果有较高的一致性（Kappa=0.652）。多重荧光PCR法检测MP阳性共67例，阳性率57.76%，其中耐药株61例，耐药率91.04%，敏感株6例，与PCR测序法相比，对MP阳性检测结果有极好的一致性（Kappa=0.929），对MRMP检测结果中度一致（Kappa=0.476）。结论 PCR测序法、AS-PCR法和多重荧光PCR法检测敏感性和特异性均较高，三种方法均可同时进行MP和MRMP检测。AS-PCR法和多重荧光PCR法操作简单，适合临床应用，能为临床诊疗快速提供MP和MRMP检测结果。AS-PCR法能检测MP耐药株和敏感株混合感染，检测敏感性好。三种检测方法可为临床医生合理用药提供数据支持。