目的 建立能够特异性检测微量肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, MP）A2063G耐药突变基因的特异性扩增等位基因的探针法实时定量PCR（probe-based allele-specific real-time PCR,探针ASPCR）方法。方法 建立特异性检测A2063G耐药突变位点的探针ASPCR方法，并验证其灵敏度、特异度及准确度等性能。结果 特异性扩增2063G和非特异性扩增2063A/G的引物/探针组合分别扩增105拷贝野生基因型（2063A）模板的Ct值的差（△Ct）高达10.93，能够特异性检测A2063G突变。探针ASPCR方法检测2063G基因型占总MP的比例的准确度可低至1%；检测MP的灵敏度低至10拷贝，检测A2063G耐药突变比例的灵敏度低至0.01%。探针ASPCR方法与前期建立的染料ASPCR方法检测临床样本的MP感染结果一致，MP阳性检出率均为94.83%（55/58），高于传统巣式PCR联合测序方法的检测结果（75.86%,44/58）；染料ASPCR方法检测MP耐药率为70.91%（39/55），高于探针ASCR方法的检测结果 63.64%（35/55）。结论新建探针ASPCR方法是一种具有高特异度、准确度和灵敏度的快速检测MP微量A2063G耐药突变的方法；与染料ASPCR方法相比，探针ASPCR方法检测耐药MP的灵敏度略低，但其临床样本检测复查率也低于染料ASPCR方法，且其结果判读简单，更适合在临床中应用推广，能够为临床制定MP及耐药MP感染的治疗方案提供理论依据。