含有绿原酸（chlorogenic acid, CA）的中药注射剂与头孢噻肟钠（cefotaxime sodium, CS）联合用药在临床上时有发生,但药物相容性的科学依据尚薄弱。本研究提出基于等温滴定量热技术、冷喷雾电离质谱技术和抑菌活性测评的序贯分析策略,评价CA与CS分子间相互作用。等温滴定量热实验表明, CA滴定CS时吉布斯自由能ΔG (0且由焓变驱动,提示二者发生了自发化学反应。通过冷喷雾电离质谱发现CA与CS混合后存在结合态特征离子m/z 808.143 5,确认CA与CS发生了化学结合。通过抑菌实验发现, CA可显著降低CS对肺炎克雷伯菌的抑菌能力（P (0.01）。进一步通过分子对接技术表明, CA与CS具有共同作用靶点青霉素结合蛋白3 （penicillin binding protein 3, PBP3）,提示CA显著降低CS抑菌能力可能与二者竞争性结合PBP3有关。综上, CA可与CS发生自发化学结合并降低其抑菌能力,为绿原酸与头孢噻肟钠相互作用评价提供了研究思路与关键技术。