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◇ 统计源期刊
◇ 北大核心
◇ CSCD-C
文章类型：
单位：
[1]首都医科大学附属北京友谊医院,北京热带医学研究所,热带病防治北京市重点实验室,北京100050
医技科室
北京热带医学研究所
北京热带医学研究所
首都医科大学附属北京友谊医院
出处：
ISSN：
关键词：
刚地弓形虫
TGGT1310420
钙离子依赖性的蛋白激酶
CRISPR/Cas9
摘要：
目的鉴定刚地弓形虫假定蛋白TGGT1310420在速殖子阶段的功能及其蛋白N端序列的亚细胞定位作用。方法在线设计针对TGGT1310420的sgRNA,通过定点突变弓形虫CRISPR/Cas9载体pSAG1::CAS9-GFP-U6::sgUPRT上的sgRNA序列获得针对TGGT1310420的CRISPR/Cas9载体。利用CRISPR/Cas9编辑技术将含有荧光蛋白mCherry和弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）的PCR片段m CherryTyHXGPRT插入至TGGT1310420内源基因编码N端前20个氨基酸残基之后。通过PCR鉴定片段是否正确插入;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹分析检测融合蛋白的表达情况。间接免疫荧光分析和共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位;空斑实验检测基因缺失株虫体表型的变化。结果 PCR和测序结果显示,成功构建了针对TGGT1310420的CRISPR/Cas9载体, mCherry-TyHXGPRT序列定点插入至靶点位置。蛋白质印迹分析结果显示, mCherry融合蛋白的相对分子质量（Mr）约为36 000;间接免疫荧光实验表明mCherry融合蛋白与弓形虫滑行相关蛋白45 （Tg GAP45）共定位于虫体的表膜。空斑实验检测结果显示, TGGT1310420的缺失并未引起虫体出现可测的表型变化。结论 TGGT1310420编码蛋白前20个氨基酸残基序列具有定位到弓形虫表膜的功能, TGGT1310420在弓形虫速殖子阶段为非必需基因。
基金：
北京市自然科学基金（No.7182023）；;首都医科大学附属北京友谊医院科研启动基金资助项目（No.yyqdkt2017-3）~~；
第一作者：
第一作者单位：
[1]首都医科大学附属北京友谊医院,北京热带医学研究所,热带病防治北京市重点实验室,北京100050
通讯作者：
推荐引用方式(GB/T 7714)：
贾永根,闫爱霞,黄敏君,等.基于crispr/cas9技术对刚地弓形虫假定蛋白tggt1310420的研究[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志.2019,37(2):150-154+160.
