目的对肺炎支原体（MP）实验室诊断方法进行比较, 评估其临床应用价值。方法前瞻性研究。采集2016年12月至2017年1月中国医科大学附属盛京医院临床诊断为MP感染的患儿咽拭子及双份血清;采集2017年3月至5月北京市朝阳区3～5岁健康儿童的咽拭子样本。采用被动凝集法（PA）检测双份血清, 以双份血清特异性抗体滴度的4倍升高或降低为金标准, 绘制受试者工作特征曲线（ROC）, 对检测MP感染的实验室方法进行比较和评估。结果 1.入组临床诊断MP感染患儿93例, 其中男42例（45.2%）, 女51例（54.8%）, 平均年龄5.5岁, 检出确诊MP感染60例（64.5%）。健康儿童349例, 男198例, 女151例, 平均年龄4.3岁, 咽拭子样本培养阳性率0.6%（2例）, 荧光定量PCR（qPCR）检测阳性18.9%（66例）。2.培养特异性最高（100.0%）, 敏感性最低（65.0%）。PA和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测急性期单份血清, 敏感性分别为71.7%、86.5%, 绘制ROC曲线提示, 目前临床采用诊断界值MP特异性抗体IgM≥1∶160并非最佳诊断界值。分子生物学诊断方法敏感性最高, 分别为RNA恒温扩增实时荧光检测（SAT）85.0%, qPCR 93.0%;但特异性较低, 分别为SAT 75.7%, qPCR 63.6%。3.同时检测患儿咽拭子MP核酸（SAT、PCR）和患儿急性期单份血清（ELISA、PA）, 敏感性提升至95.0%～100.0%, 特异性63.6%～75.7%。结论分子生物学诊断MP感染敏感性高, 其存在无症状感染或感染后携带, MP检测阳性, 是否需要治疗需结合临床。检测病程1周左右的急性期单份血清敏感性高, 对MP感染诊断有参考价值, 但确诊需结合临床;采用急性期单份血清学检测方法结合SAT较单独应用检测MP感染的敏感性及准确性高。